Anlagerung von Aβ-Peptiden an das Gangliosid GM-1

Projektdetails:

Thematik: Grundlagenforschung
Förderstatus: abgeschlossen
Art der Förderung: Standard Projekt
Institution: Goethe-Universität Frankfurt, Pharmakologisches Institut für Naturwissenschaftler
Projektleiter: Prof. Dr. Gunter P. Eckert
Laufzeit: 01. November 2008 - 31. Oktober 2010
Fördersumme: 72.000,00 Euro
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Projektbeschreibung

Das Altern ist der deutlichste Risikofaktor für die Alzheimer-Dememz (AD). Nachweislich entwickeln sich die klinischen und pathologischen Merkmale der sporadischen AD vielfach aus dem normalen Alterungsprozess. Die mit zunehmendem Alter einhergehende, verminderte Flexibilität von Nervenzellmembranen ist möglicherweise die optimale Voraussetzung für die Produktion des neurotoxischen Aß-Peptids. Aß-Peptide werden für die Entstehung von AD mitverantwortlich gemacht. Dr. Gunter Eckert, Universität Frankfurt, stellt die Hypothese auf, dass Aß mit den Zellwänden der Nervenzellen im Gehirn interagiert, indem es an ein bestimmtes Molekül, dem so genannte Gangliosid GM-1, bindet und so die Bildung von Aß-Peptid aus seinem Vorläuferprotein beschleunigt.

Die Erforschung wie unterschiedlich lange Aß-Peptidketten mit GM-1 in den Plasmamembranen interagieren wird neue Einblicke in mögliche, eine Neurodegeneration auslösende pathologische Ereignisse eröffnen und stellt ein viel versprechendes, neues Ziel für therapeu­tische oder präventive Eingriffe bei AD dar. Die zeitabhängige Anlagerung von Aß an GM-1 wird mit Hilfe einer völlig neuen Methode untersucht, die sich der Massenspektrometrie bedient. Des Weiteren wird der Ein­fluss der Peptidstruktur von Aß auf die Anlagerung an GM-1 mit Fluoreszenztech­niken geklärt. Biosynthese und Abbau von GM-1 in lebenden neuronalen und nicht­neuronalen Zellen werden z. B. durch spezifische Hemmstoffe beeinflusst, so dass die Bindungseigenschaften von Aß an GM-1 in Zusammenhang mit seinem Vorkommen an der Plasmamembran erforscht werden können.

Die physikalisch-chemischen Eigenschaften lebender Zellen werden moduliert und die Auswirkungen auf die Anlagerung von Aß an GM-1 werden beurteilt. Ferner sollen mit Hilfe modernster Techniken Proteine identifiziert werden, die bei der Bindung von Aß an GM-1 eine Rolle spielen.

Zwischenbericht

Im ersten Jahr der Förderung sind wir der Hypothese nachgegangen, dass Aβ mit den Zellwänden der Nervenzellen interagiert, indem es an ein bestimmtes Molekül, dem so genannte Gangliosid GM-1, bindet und so die Bildung von Aβ-Peptid aus seinem Vorläuferprotein beschleunigt. Mit Hilfe von aufwendigen Bildern konnte belegt werden, dass Aβ mit den Plasmamembranen von kultivierten Zellen interagiert (siehe Bild).

Versuche mit Choleratoxin Subunit B, das spezifisch mit GM-1interagiert, zeigten ähnliche Effekte wie die Zugabe von Aβ zu den Zellen: Die Interaktion mit GM-1 reduziert die Membranfluidität und induziert gleichzeitig die Bildung von Aβ. Um die Bindung on Aβ an GM-1 genauer zu beschreiben, wurde eine massenspektroskopische Methode entwickelt, diees erlaubt die Bildung kleiner Peptid-Aggreate, sogenannter Oligomere zu beobachten. Mit Hilfe dieser Technik soll nun untersucht werden, ob GM-1 selbst die Oligomerisierung von Aβ anregt.

Weiterhin soll das Projektes den Einfluss der Membranfluidität auf die Bildung von Aβ erforschen. Mit Hilfe von Substanzen, die die Membranfluidität von Zellen erhöhen oder erniedrigenkonnten wir im letzten Jahr zeigen, dass die Membranfluidität per se Einfluss auf den Prozessierungsweg des Amyloid-Vorläufer-Proteins nimmt. Es bleibt immer noch unerforscht, wie genau Aβ etwa nach Bindung an GM-1 die Membranfluidität erniedrigt und zu Fehlfunktionen von Zellen führt. Neuere Erkenntnisse deuten darauf hin, dass GM-1 an sogenannte kleine G-Proteine der Rho-Familie bindet. Diese sind für die Interaktion mit dem Stützskelett der Zellen notwendig. Unsere aktuellen Forschungsergebnisse geben Hinweise darauf, dass Rho-Proteine bei der Entstehung der Alzheimer Erkrankung von Bedeutung sein könnten und sind wir gerade dabei deren Einfluss auch für die Interaktion von Aβ mit GM-1 zu ergründen.

Zwischenbericht Jahr 2

Das aktuelle Projekt beschäftigt sich mit den molekularen Mechanismen, die für die Interaktion von oligomerem Ab mit zellulären Strukturen verantwortlich sind. Es ist bekannt, dass prenyliertes Rac1-Protein mit Gangliosid GM-1 reichen Membranbereichen assoziiert und wir untersuchen zur Zeit, inwieweit eine mögliche Interaktion von Rac1 mit GM-1 die Bildung von Ab favorisiert. Dass GM-1 in die Bildung von Ab involviert ist, konnten wir kürzlich zeigen: Oligomeres Ab bindet an membranständiges GM-1 und fördert die amyloidogene Prozessierung von APP (Peters et al. BBA 2009).

Im Zusammenhang der Untersuchungen zu den Interaktionen von Aß mit GM-1 Gangliosiden, stellte sich die Frage, ob GM-1 Ganglioside die Oligomerisierung von Aß favorisieren. Da die zur Verfügung stehenden Methoden, wie native Gelelektrophorese und anschließender Silberfärbung oder die Elektronenmikroskopie keine quantitativen Aussagen erlauben, haben wir in Zusammenarbeit mit dem Institut für theoretische und physikalische Chemie, eine neuartige Methode zur quantitativen Detektion von Aß Oligomeren entwickelt. Mit Hilfe der auf Massenspektrometrie-basierenden LILBID (laser-induced liquid bead ion desorption) Technik, lässt sich die zeitabhänige Oligomerisierung von Aß verfolgen.

Über die kleine GTPase Rac1 sind meine Untersuchungen zu den molekularen Mechanismen der Ab Toxizität mit einem weiteren Forschungsschwerpunkt verknüpft: Für die Aktivierung von Rac1 ist initial eine Prenylierung mit Geranylgeranylpyrophosphat (GGPP) notwendig, welches als lipophiles Ankermolekül die membranassoziierte Lokalisation des Rho-Proteins ermöglicht. In diesem Zusammenhang konnten wir kürzlich zeigen, dass der Gehalt von GGPP im Gehirngewebe von Alzheimer Patienten signifikant erhöht ist (Eckert et al. Neurobiol Dis. 2009). Aktuell zeigen unsere  Untersuchungen, dass die Unterbindung der Übertragung von GGPP auf Rac 1 Protein die zelluläre Bildung von Ab nicht beeinflusst (Hooff et al. Mol. Neurobiol. 2010).

Abschlussbericht

Im ersten Jahr der Förderung sind wir der Hypothese nachgegangen, dass Ab mit den Zellwänden der Nervenzellen interagiert, indem es an ein bestimmtes Molekül, dem so genannte Gangliosid GM-1, bindet und so die Bildung von Aβ-Peptid aus seinem Vorläuferprotein beschleunigt. Um die Bindung on Aβ an GM-1 genauer zu beschreiben, wurde eine massenspektroskopische Methode entwickelt, die es erlaubt die Bildung kleiner Peptid-Aggreate, sogenannter Oligomere zu beobachten. Dieses neue Verfahren – LILBID genannt – wurde etabliert und bereits publiziert. Wir können, wie propagiert, die molekulare Bildung von oligomerem Ab molekular überwachen und zeigen, dass bekannte Inhibitoren der Ab Aggregation die Oligomerizierung komplett aufheben.

Unserer Hypothese nach, sollte eine Erhöhung der Membranfluidität die Bildung von Ab reduzieren und einen Zellschutz bieten. Wir haben daher Zellen mit der ungesättigten omega-3 Fettsäure Docosahexaensäure (DHA) behandelt und konnten nachweisen, dass DHA die Membranfluidität erhöhte, die Bildung von Ab senkt und Zellen vor mitochondrialer Dysfunktion schützt. Neuere Erkenntnisse deuten darauf hin, dass GM-1 an sogenannte kleine G-Proteine der Rho-Familie bindet.

Diese sind für die Interaktion mit dem Stützskelett der Zellen notwendig. Analog zu den bereits für post-mortem Gewebe von AD Patienten publizierten Daten, konnten wir aktuell zeigen, dass die Gehalte der beiden Isoprenoide FPP und GGPP im Gehirngewebe von alten Mäusen signifikant erhöht sind. Da das Altern der wichtigste Risikofaktur für AD darstellt, haben wir uns im weiterern mit Lipidstoffwechsel relevanten Parametern im Gehirn alter Mäuse zu gewandt.

So haben wir im Gehirn unterschiedlich alter Mäuse den Gehalt von Gangliosiden gemessen. Interessanterweise, sind die Gehalte an GM-1 scheinbar nicht signifikant verändert, wohl aber die Gesamtmenge an Sialylsäure signifikant erniedrigt ist. Der Sialylsäuregehalt stellt einen Marker für den Gesamtgangliosidgehalt dar. Der altersbedingte Unterschied im Phospholipidgehalt kommt hauptsächlich durch GD1a zustande. Somit scheint sich ein verändertes Gangliosidmuster im Alter als Risikofaktor für molekulare Mechanismen im Rahmen der AD abzuzeichnen.

Wissenschaftliche Publikationen auf Basis des geförderten Projekts

Cernescu, M., Stark, T., Kalden, E., Kurz, C., Leuner, K.,  Deller, T., Göbel, M., Eckert, G.P., Brutschy, B. (2012). Laser-Induced Liquid Bead Ion Desorption Mass Spectrometry: An Approach to Precisely Monitor the Oligomerization of the β-Amyloid Peptide. Analytical Chemistry 84:5276-5284.

Eckert, G.P., Wood, W.G., Müller, W.E. (2010). Lipid membranes and beta-amyloid: a harmful connection. Current Protein & Peptide Science, 11(5):319-25.

Eckert, G.P., Chang, S., Eckmann J., Copanaki, E., Hagl, S., Hener, U., Müller, W.E., Kögel, D. (2011). Liposome-incorporated DHA increases neuronal survival by enhancing
non-amyloidogenic APP processing. Biochimica et Biophysica Acta 1808:236–243.

Hooff, G.P., Patel, N., Wood, W.G., Müller, W.E., Eckert, G.P., Volmer, D.A. (2010). A rapid and sensitive assay for determining human brain levels of farnesyl-(FPP) and geranylgeranylpyrophosphate (GGPP) and transferase activities using UHPLC-MS/MS. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 398:1801-1808.

Hooff, G.P., Peters, I., Wood, W.G., Müller, W.E., Eckert, G.P. (2010). Modulation of cholesterol, farnesylpyrophosphate, and geranylgeranylpyrophosphate in neuroblastoma SH-SY5Y-APP695 cells: impact on amyloid beta-protein production. Molecular Neurobiology, 41(2-3):341-50.

Hooff, G.P., Wood, W.G., Müller, W.E., Eckert, G.P. (2010). Isoprenoids, small GTPases and Alzheimer's disease. Biochimica et Biophysica Acta (BBA), 1801(8):896-905.

Hooff, G.P., Wood, W.G., Kim, J.-H., Igbavboa, U., Ong, W.-Y., Müller, W.E., Eckert, G.P. (2012). Brain Isoprenoids Farnesyl Pyrophosphate and Geranylgeranyl Pyrophosphate are Increased in Aged Mice. Molecular Neurobiology.

Wood, W.G., Eckert, G.P., Igbavboa, U., Müller, W.E. (2010). Statins and neuroprotection: a prescription to move the field forward. Annals of the New York Academy of Sciences, 1199:69-76.

Peters, I., Igbavboa, U., Schütt, T., Haidari, S., Hartig, U., Böttner, U., Copanaki, E., Deller, T., Kögel, D., Wood, W.G., Müller, W.E., Eckert, G.P. (2009). The interaction of beta-amyloid protein with cellular membranes stimulates its own production. Biochimica et Biophysica Acta, 1788(5):964-72.


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